Биопринтер для клеточной селекции растений в ЮФУ

1. 1
   Клиент - Южный федеральный университет: гибридизация, новые сорта и их адаптация к климату юга России.
2. 2
   Оборудование - SunP BioMaker 2i: настольный биопринтер с двумя модульными головками, стерилизацией UV-C и подачей без компрессора.
3. 3
   SunP описывает прибор для тканевой инженерии и регенеративной медицины, растений в списке применений нет. Но под задачу ЮФУ его свойства подходят: стерильная камера, две головки, гидрогели с температурной и световой сшивкой.
4. 4
   Направление молодое: в 2022 году напечатанные клетки сои дали микрокаллусы за две недели, в 2024 году из клеток табака напечатали «лист» с двумя пигментами.
5. 5
   Принтер не заменяет селекционера и полевые испытания: он делает лабораторный этап воспроизводимым.

Классическая селекция идёт годами: семеноводческая компания KWS оценивает путь от скрещивания до сорта в восемь-двенадцать лет плюс около трёх лет на допуск. Большую часть времени занимают полевые испытания: вырастить, дождаться урожая, отобрать перспективные линии и повторить цикл.

Клеточные методы переносят часть отбора в лабораторию. Из тканей растения выделяют клетки или протопласты - клетки, с которых ферментами сняли жёсткую оболочку. Протопласты разных растений сливают и получают гибрид там, где опыление не работает. Культуру ставят в стрессовые условия и смотрят, какие линии их переносят, а из выживших клеток регенерируют растение.

Для юга России это прикладной вопрос: главные риски здесь - засуха, жара, суховеи и засоление почв. На гибридизацию, создание сортов и их адаптацию к местным условиям и нацелена лаборатория ЮФУ.

Обычно клеточную культуру растят во взвеси в колбе или на агаре в чашке: клетки распределяются случайно, два одинаковых образца получить нельзя. Для единичного опыта это терпимо, для сравнения десятков линий - погрешность, которую трудно отделить от биологии.

Биопринтер снимает эту проблему геометрией: он укладывает клетки в гидрогеле по цифровой модели, слоями или сеткой, с заданной плотностью. Каждый образец повторяет предыдущий, поэтому разница в результатах относится к линии клеток, а не к способу посева.

Второй эффект - объём: в трёхмерном гидрогеле клетка окружена соседями и средой со всех сторон, как в ткани. Плоская культура такого окружения не воспроизводит.

Что уже получилось в мировой практике

В 2022 году группа Университета штата Северная Каролина опубликовала протокол печати живых клеток арабидопсиса и сои (Van den Broeck и соавторы, Science Advances, 2022). Протопласты корня печатали в легкоплавкой агарозе: сразу после печати живыми оставались 62,2 % клеток меристемы и 51,6 % клеток дифференцированной ткани, а ручное пипетирование дало 44,9 % и 48,6 %. Сама печать клетки не губила.

Дальше клетки повели себя как живая культура: первые деления пошли на третьи сутки, а за 7-10 дней около 12 % конструкций дали микрокаллус - колонию из четырёх и более клеток, с которой начинается регенерация растения. Для сои взяли свои биочернила и иглу примерно вдвое шире, чтобы снизить нагрузку: через 14 суток живыми были 43 % клеток, микрокаллусы образовались в 90 % конструкций.

Вторая работа показывает, что напечатанной культурой можно управлять генетически. В 2024 году группа Нанкинского технологического университета, Кембриджа и Института Эрлема напечатала клетки табака BY-2 в гранулированном гидрогеле вместе с агробактериями, и за 48 часов бактерии перенесли в клетки нужные гены (Wang и соавторы, ACS Central Science, 2024).

Нагляднее всего «лист», напечатанный двумя чернилами: одни несли гены красного пигмента для жилок, другие - жёлтого для мякоти. К 24-м суткам на разросшейся конструкции проявился двухцветный рисунок: клетки в разных её частях работали по заданной программе.

Обе работы - внешний контекст, а не результаты лаборатории ЮФУ: они показывают, что методы работают, но общих протоколов пока нет.

Растительная клетка защищена жёсткой стенкой из целлюлозы, но для слияния протопластов её снимают. Клетка становится хрупкой: её легко повредить давлением и сдвигом в сопле. Отсюда требования к подаче материала.

Второе ограничение - время. Культура растёт медленно: микрокаллусы появлялись через одну-две недели, рисунок на «листе» - на 24-е сутки. Всё это время образец должен оставаться стерильным, а колония бактерий удваивается за десятки минут, поэтому стерильная камера здесь не удобство, а условие работы.

Третье - биочернила. Гидрогель должен течь при печати и быстро застывать после неё, удерживая клетки в заданной геометрии. В 2022 году это была легкоплавкая агароза при 37 °C, в 2024-м - GelMA, который сшивается под светом: два разных механизма, и прибор должен уметь оба.

Четвёртое - несколько материалов в конструкции: клетки в одном геле, поддерживающая структура или другая среда в другом, как в опыте с жилками и мякотью. Одной головкой так не напечатать.

BioMaker 2i - средняя модель в линейке настольных биопринтеров SunP, экструзионная биопечать: материал выдавливается через сопло и укладывается слой за слоем. Корпус 480 × 420 × 500 мм встаёт на лабораторный стол, платформа держит температуру от 4 до 60 °C. Полный список характеристик - в карточке биопринтера SunP BioMaker 2i.

Две модульные головки

Головки ставят в держатель без инструмента и подбирают под задачу: двустороннее терморегулирование 10-70 °C, фотоотверждение 365 и 405 нм, термоплавкая головка для электроспиннинга из расплава до 270 °C и коаксиальное сопло. Установлены одновременно две, работают они в одном задании.

Для растительных культур нужна комбинация попроще: клетки в одном геле, среда или поддерживающая структура в другом, либо две линии клеток рядом. Слои совмещает автоматическая калибровка.

Стерильность без ламинарного шкафа

Камеру обеззараживает ультрафиолет диапазона C. Сверху ставится опциональный модуль с фильтром HEPA: он подаёт внутрь очищенный воздух и держит избыточное давление, так что пыль снаружи не затягивается. С обеими системами принтер работает вне шкафа биологической безопасности, а за печатью следят через прозрачную дверь.

Подача без сжатого воздуха

Большинство экструзионных биопринтеров выдавливают материал сжатым воздухом, и объём на выходе зависит от давления, вязкости и остатка в шприце. В BioMaker 2i поршень двигает привод, объём задаётся его ходом: вязкие пасты идут без компрессора, жидкие чернила не подтекают.

Расходники и программа

Головки рассчитаны на одноразовые шприцы BD на 5 мл, для 3 мл есть адаптер - фирменные картриджи не нужны. Программа SunP на Windows режет модель на слои и назначает материалы головкам, связь по Bluetooth или USB. Область печати SunP не публикует: этот параметр уточняем у производителя вместе с коммерческим предложением.

В линейке настольных биопринтеров SunP три машины, различаются они числом головок. Выбор определило то, сколько материалов нужно совместить в конструкции.

1. 1
   BioMaker 1 с одной головкой и модулем фотоотверждения подходит, чтобы отрабатывать биочернила. Клетки вместе с каркасом или вторую линию рядом он не напечатает, и своей стерилизации у него нет: прибор работает внутри шкафа биобезопасности.
2. 2
   BioMaker 2i с двумя головками закрывает основные сценарии работы с растительными культурами и сам держит стерильность камеры.
3. 3
   BioMaker 4 с четырьмя головками и адаптером вращающейся оси нужен для многокомпонентных конструкций вроде трубок сосудов: для клеток растений избыточен, корпус крупнее - 680 × 520 × 540 мм.
4. 4
   Настольный формат и своя камера позволяют поставить принтер в существующую лабораторию без перепланировки.

Полезная деталь: в работе 2022 года принтер дорабатывали сами, добавляя стерилизацию и вторую головку. В BioMaker 2i и то, и другое заложено в конструкцию.

Биопринтер - одно звено цепочки: перед ним выделение клеток и приготовление биочернил, после - культивирование и отбор устойчивых линий. Ниже типичная последовательность; конкретные протоколы лаборатория ЮФУ выбирает сама.

Печать занимает минуты, культивирование и отбор - недели. Главный вклад прибора не в скорости, а в том, что все образцы раунда сделаны одинаково.

Гидрогели для фотоотверждения вроде GelMA и фотоинициатор к нему есть в разделе биочернил для биопринтера, но для клеток растений состав среды, фитогормоны и тип геля подбирают отдельно: готовых наборов под эту задачу рынок пока не предлагает.

Прежде всего перенос инструмента в другую отрасль. BioMaker 2i создавался для медицины: каркасы кости и хряща, модели тканей и опухолей, работа со стволовыми и нервными клетками. Растений в списке нет, но те же свойства прибора - стерильная камера, щадящая подача, два материала за цикл - решают и задачу лаборатории ЮФУ.

Второе - несоразмерность прибора и задачи: засухоустойчивый сорт это урожай на тысячах гектаров, а путь к нему начинается с клеток в капле геля на платформе настольного принтера.

Третье - честность направления. В опубликованных работах речь о жизнеспособности клеток и первых делениях, а не о готовых сортах: принтер не заменяет селекционера, теплицу и поле. О первых результатах лаборатории рассчитываем рассказать отдельно.

До ЮФУ мы разбирали поставку биопринтера Dr. INVIVO 4D6 в МИРЭА, а о том, кто стоит за самим прибором, рассказывали в материале о Вэй Суне и компании SunP Biotech.

1. 1
   Начинайте с биологии: какие клетки, в каком материале и какую структуру нужно получить - от этого зависят типы головок и режимы.
2. 2
   Оцените стерильность. Если шкафа нет или он занят, берите модель со своей стерилизацией камеры и фильтрацией воздуха.
3. 3
   Посчитайте материалы в одной конструкции: один - хватит одной головки, клетки плюс каркас или среда - нужны две, сложные конструкции - четыре.
4. 4
   Проверьте расходники: принтер под стандартные шприцы не привязывает лабораторию к фирменным картриджам.
5. 5
   Заложите контрольный опыт: сравните жизнеспособность клеток после печати и после ручного пипетирования, как в работе 2022 года.
6. 6
   Заложите время на подбор биочернил: для растительных культур это отдельный этап, а не настройка принтера.

Можно ли печатать растительные клетки на биопринтере?

Да. В 2022 году напечатанные протопласты арабидопсиса делились с третьих суток, а клетки сои через две недели образовали микрокаллусы в 90 % конструкций. Биочернила для растительных клеток делают на основе агарозы, альгината натрия или метакрилированного желатина с питательной средой и фитогормонами.

Зачем биопринтер в клеточной селекции растений?

Он делает опыты сравнимыми. Клетки ложатся в заданную трёхмерную структуру одинаково от образца к образцу, поэтому разницу в выживаемости и делении можно отнести к линии, а не к способу посева. Так сравнивают десятки линий задолго до выхода в поле.

Нужен ли для биопринтера ламинарный шкаф?

Зависит от модели. У SunP BioMaker 2i камера обеззараживается ультрафиолетом диапазона C, а модуль HEPA держит внутри избыточное давление очищенного воздуха, поэтому прибор работает и в обычной лаборатории. BioMaker 1 своей стерилизации не имеет: его ставят в шкаф биологической безопасности.

Какие головки нужны для печати клеток растений?

Зависит от того, как сшиваются биочернила. Альгинат и агарозу печатают головкой с терморегулированием: у SunP BioMaker 2i она держит температуру шприца от 10 до 70 °C, и гель не застывает в игле раньше времени. Метакрилированный желатин сшивают светом, для него нужна головка фотоотверждения на 365 или 405 нм. Две головки позволяют уложить в одну конструкцию два материала, например клетки в одном геле и опорную решётку или питательную среду в другом.

Чем клеточная селекция растений отличается от классической?

Классическая селекция идёт через скрещивания и отбор в поле, поколение за поколением, поэтому новый сорт выводят годами. Клеточная селекция растений переносит часть отбора в лабораторию: устойчивость к засолению, засухе или токсинам проверяют на культуре клеток, добавляя стрессовый фактор в среду, и в работу идут только выжившие линии. Поле она не заменяет, зато отсекает слабые варианты раньше и дешевле.

Прибор, созданный для тканевой инженерии, уехал в Ростов-на-Дону работать на селекцию растений: для молодой технологии это нормальный ход вещей. Лаборатории ЮФУ биопринтер даёт воспроизводимость - одинаковую геометрию образцов, стерильную камеру на недели опыта и два материала в одной конструкции.

Ожидания при этом стоит держать честными. Биопечать растительных клеток - молодое направление: стандартных протоколов пока нет, режимы печати, состав биочернил и сроки культивирования каждая лаборатория подбирает под свои линии. Новый сорт через полгода никто не обещает. Принтер не заменяет селекционера, опытное поле и государственное сортоиспытание, он ускоряет и делает воспроизводимым лабораторный этап, на котором слабые линии отсеиваются ещё до посева. Поэтому первые месяцы работы с прибором уходят на подбор режимов под собственные линии клеток, и это нормальная часть внедрения, а не признак неудачи.

Если подбираете оборудование для похожих задач, посмотрите раздел биопринтеров и отраслевые страницы для науки и образования и для медицины. Расскажите, с какими клетками работает ваша лаборатория, и мы подберём конфигурацию: наши контакты - на отдельной странице.